referat, referate , referat romana, referat istorie, referat geografie, referat fizica, referat engleza, referat chimie, referat franceza, referat biologie
 
Astronomie Istorie Marketing Matematica
Medicina Psihologie Religie Romana
Arte Plastice Spaniola Mecanica Informatica
Germana Biologie Chimie Diverse
Drept Economie Engleza Filozofie
Fizica Franceza Geografie Educatie Fizica
 

Metode biochimice utilizate in aprecierea efectului poluantilor din mediu asupra organismului

Categoria: Referat Chimie

Descriere:

Mod de lucru : în balonul cu fundul rotund de la aparatul de distilat mercur se introduc 2 g păr, câţiva ml de apă bidistilată, 10 ml acid azotic, 10 ml apă oxigenată şi 2 ml clorură stanoasă 10% în acid clorhidric. Se fixează balonul la parat şi se da drumul la foc foarte încet...

Varianta Printabila 


untitled

Generalităţi: prezenţa sulfiţilor n snge a fost considerată ca indicator de expunere la bioxidul de sulf. Incostanta cu care au fost puşi n evidenţă, semnificaţia acestui indicator bichimic la expunerile la concentraţii ridicate.

Principiul metodei: bioxidul de sulf din snge formează cu reactivul fuxin formolic un complex colorat a cărui intensitate este proporţională cu concentraţia.

Reactivi:

-formaldehidă, soluţie 40%;

-pararozanilină 3% n soluţie alcoolică;

-reactiv fuxin-formolic;

-hidroxid de potasiu, soluţie alcoolică 1%;

-soluţie saturată de clorură mercurică(HgCl2);

-soluţie etalon stoc pentru  bioxid de sulf;

-soluţie etalon de lucru.

Recoltarea probelor de snge: sngele care se recoltează din deget e un anticoagulant.

Mod de lucru: ntr-o eprubetă de centrifugă se introduc 0,5 ml soluţie alcoolică de KOH 1%, 2,2 ml apă bidistilată şi 0,2 ml snge. Eprubeta se agită timp de 2-3 minute apoi se adaugă 1 ml soluţie saturată de clorură mercurică, agitnd din nou. Se centrifughează la 4000 turaţii, timp de 5 minute şi apoi se iau cu atenţie din supernatant 2 ml şi se introduc ntr-o eprubeta peste care se adauga 4 ml reactiv foxin-formolic. Dupa 5’ se citeşte extincţia la spectrofotometru la lungimea de undă de 570 nm n cuva de 1 cm. Valoarea extincţiei se raportează la curba de etalonare care se ntocmeşte după schema de mai jos:

Concentraţia SO2/proba

g

0

1

3

5

7

9

10

Soluţia etalon de lucru

ml

0

0,1

0,3

0,5

0,7

0,9

1,0

Apă bidistilată

ml

1,5

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,5

Soluţia de clorură mercurică

ml

Cte 0,5 ml

Reactiv fuxin-formolic

Ml

Cte 4 ml

    După fiecare adăugare de reactiv se agită eprubetele. Se lasă apoi 5’ n repaus şi se citeşte extincţia n aceleaşi condiţii ca şi proba. Se trasează curba de etalonare.

                        Calcul: mg SO2% =c/v ·10

                        C =concentraţia ng SO2 din proba de snge;

                        V =cantitatea de snge luată n lucru, n ml.

 

 

 

  


Determinarea fluorului din urină

 

Generalităţ: calea principală de eliminare a fluorului din organism este cea renală. La o ingestie normală de fluor, concentraţia fluorului urinar este proporţională cu ingestia. Dacă organismul este expus la concetraţie crescută de fluor, nivelul fluorului din urină creşte, dar fără a se menţine proporţionalitatea cu gradul de expunere.

Principiul metodei: fluorul este separat din urină prin microdifuzie sub forma de HF, care este prins pe o peliculă de hidroxid de sodiu ca fluorura de sodiu. Dozarea se face colormetric, prin decolorarea lacului SPANDS- azotat de thoriu, proporţional cu concentraţia fluorului.

Reactivi şi material necesar:

-hidroxid de sodiu: soluţie alcoolică 0,05 N;

-acid percloric 70%;

-azotat de thoriu 0,004M;

-soluţie etalon stoc pentru fluor;

-SPANDS, 0,004 M;

-soluţie etalon stoc entru fluor;

-soluţia etalon de lucru;

-sulfat de argint, pulbere;

-acid clorhidric 0,05;

-2,5 ml soluţie de azotat de thoriu 0,004 M;

-5,0 ml soluţie SPANDS 0,004 M;

-0,04 soluţie de HCl 0,05 N;

-apă bidistilată;

-cutii din polistiren folosite la ambalajul medicamentelor (faringosept sau B complex);

-capace din plastic cu care se astupă flacoanele de vitamina C.

Recoltarea se face din urina din 24 de ore, ntr-un recipient de polistiren.

Mod de lucru: 2 ml urină se introduc ntr-un capacel de plastic care se amplasează n capacul unei cutii de polistiren. n corpul aceleiaşi cutii se introduce 1 ml soluţie alcoolică de hidroxid de sodiu şi se lasă la etuvă la 60˚C pentru evaporarea alcoolului şi formarea peliculei de hidroxid de sodiu.

n căpăcelul cu urină se introduc 0,1g sulfat de argint şi 2 mg acid percloric, se nchide imediat cutia şi se lipeste o fşie de leucoplast n jurul cutiei pentru a evita pierderile de fluor.

Paralel cu proba, n condiţiile identice se procedează pentru proba martor (apa bidistilată) şi 5 etaloane care conţin cantităţi succesive de fluor (1; 3; 5; 7; 10 g F) introducndu-se n fiecare căpăcel cte 0,1; 0,3; 0,7;  şi 1,0 ml soluţie etalon de lucru de fluorură de sodiu. Se completeaza apoi volumul cu apă bidistilată pnă la 2 ml. n continuare se procedează ca şi pentru proba de urină. Cutiile bine nchise se introduc n etuvă la 58˚-60˚C, timp de 20 ore pentru realizarea difuziei.

Se scot cutiile de la etuvă şi n corpul cutiei unde s-a realizat pelicula de hiroxid şi fixarea fluorului se introduc 2 ml apă bidistilată, 4 ml acid clorhidric 0,05 N şi 4 ml lac SPANDS-azotat de thoriu.După 10’ se citeşte extincţia de la spectrofotometru la lungimea de undă de 580 nm n cuva de 1 cm. Cu valorile extincţiilor obţinute pentru proba martor şi etaloane se trasează o curbă.

Calcul: mg F/dm3 = c/v

C =concentraţia n g fluor din proba de urină luată n lucru;

V =cantitatea de urină luată n lucru, n ml;

Obs.: concentraţia fluorului n urină la o expunere normală de fluor este ntre 0,5-1,5 mg/dm3.

 

 

Determinarea mercurului din urină

 

            Generalităţi: creşterea concentraţiei mercurului n urină poate indica depozitarea de mercur sau intoxicaţie cu acest metal. Totuşi rezultatele sunt neconstatate, după pătrunderea n organism mercurul dispărnd repede din snge n urină. Mai constant şi cu valoare mai ridicată pentru diagnosticul de expunere este determinarea Hg n păr şi unghii.

            Principiul metodei: mercurul formează cu difeniltiocarbazona un complex colorat la pH =1,5-2,0.

Reactivi:

-E.D.T.A-Na2, soluţie 0,1 N;

            -acid sulfuric conconentrat d= 1,84;

            -acid sulfuric diluat;

            -permanganat de potasiu, soluţie saturată;

            -galben de metanil, soluţie 0,1%;

            -roşu de fenol, soluţie 0,1%;

            -ditizonă, soluţie stoc 0,1% n cloroform;

            -ditizonă soluţie de lucru;

-soluţie de hidroxilamină 10%;

            -soluţia e spălare;

            -toluen pur;

-soluţia etalon stoc pentru mercur;

            -amoniac concentrat.

            Recoltarea probelor: urina se recoltează din prima emisiune de dimineaţă sau urina colectată n 24 ore (vasele n care se face recoltarea trebuie bine clătite) cu soluţie de acid azotic (1:25) şi apoi cu apa bidistilată.

            Mod de lucru: ntr-o capsulă  de porţelan se introduc 50 ml  urină, 5 ml H2SO4  concentrat (d =1,840) şi 15 ml soluţie saturată de permanganat de potasiu. Se ncălzeşte moderat pe baia de nisip fără a ajunge la fierbere, acoperind vasul cu o sticlă de ceas, pnă ce lichidul supernatant devine limpede şi incolor prezentnd pe fundul vasului un precipitat brun. Dacă precipitatul lipseşte nseamnă că trebuie să se mai adauge soluţie de permanganat de potasiu şi se continuă ncălzirea pnă ce lichidul supernatant se decolorează complet. După răcire excesul de permanganat se ndepărtează cu hidroxilamina adăugnd picătură cu picătură pnă la disparţia precipitatului brun şi apoi un exces de 5 ml hidroxilamină. Se trece proba cantitativ ntr-o plnie de separare, se ajustează pH-ul la 1,2-2,0 aşa cum s-a arătat la determinare mercurului din aer şi se procedează n continuare la fel ca şi la aer.

            Calcul: g mercur/dm3 urină = C x 20

C = concentraţia n g mercur din proba de urină luată n lucru g mercur/urina din 24 ore = C x 20 x V24.

V24 = cantitatea de urină colectată n 24 ore, n litri.

Obs.: valoarea normală a mercurului n urină este de 30 g/urina din 24 ore.

  

Determinarea mercurului din păr

 

Principiul metodei: ionii de mercur n mediul acid formează cu difenilcarbazona un complex colorat n portocaliu, ditizonatul de mercur, care se extrage cu toluen şi se poate colorimetra.

Reactivi şi material necesar:

-acid azotic d= 1.41 şi soluţii apoase de 2% şi 10% n volume;

-acid sulfuric d= 1,84 şi soluţie apoasă de 50% n volume;

-hidroxid de amoniu soluţie 25%;

-parmangant de potasiu soluţie saturată;

-clorură stanoasă10% n HCl concentrat;

-galben de metalin soluţie apoasă 0,1%;

-roşu de fenol 0,1;

-ditizonă soluţie stoc 0,1% şi 0,5%;

-ditizonă, soluţia de lucru;

-clorhidrat cu hidroxilamină, soluţie 10%;

-E.D.T.A.- sarea de sodiu;

-clorură stanoasă soluţie 10%;

-soluţia de spălare;

-soluţie etalon stoc;

-apă bidistilată n prezent permanganatului de potasiu şi hidroxidului de sodiu.

Mod de lucru : n balonul cu fundul rotund de la aparatul de distilat mercur se introduc 2 g păr, cţiva ml de apă bidistilată, 10 ml acid azotic, 10 ml apă oxigenată şi 2 ml clorură stanoasă 10% n acid clorhidric. Se fixează balonul la parat şi se da drumul la foc foarte ncet. Se distilează aproximativ 1/2 oră şi se continuă determinarea la fel ca la determinarea mercurului din apă.


Determinarea plumbului n snge

 

Generalităţi: plumbul se găseşte n snge att sub forma anorganică ct şi legat de unele substanţe organice. Cea mai mare parte a plumbului din snge, se găseşte n eritrocite. Concentraţia plumbului n snge ne dă indicaţii cu privire la indigestia şi eliminarea lui n organism, mai precis la cantitatea de plumb pe care organismul o fixează.

Principiul metodei: plumbul are proprietatea de a reacţiona cu difenilcarbazona, n mediul alcalin cu care formează un complex colorat n roşu, ditizonatul de plumb, colorimetrabil.

Reactivi:

-acid azotic (d= 1,40);

-acid azotic 1% şi 0,05% n clorofrom;

-cloroform;

-ditizonă 0,01% şi 0,05% n cloroform;

-soluţia tampon de citrat;

-soluţia de spălare;

-soluţia etalon stoc pentru plumb;

-soluţia etalon de lucru;

-acid tricloracetic 10% şi 5%;

-acid percloric 70%.

Recoltarea: sngele se recoltează prin puncţie venoasă cu un ac sterilizat prin fierbere n apă distilată, pe fluorura de sodiu (0,1) ca anticoagulant.

Modul de lucru: 10 ml de snge bine omogenizat se introduc ntr-o eprubeta de centrifugă de 50 ml n care se află 10 ml apă bidistilată. Se amestecă bine cu o baghetă de sticlă pentru a se realiza hemoliza şi apoi se adaugă 10 ml acid tricloracetic 10%, picătură cu picătură sub agitare continuă. Se lasă apoi o oră n repaus şi se centrifughează la 3000 turaţii, timp de 5’. Supernatantul se trece ntr-o capsula de porţelan. n eprubeta de centrifugă se mai adaugă 10 ml acid tricloraceti. Se adaugă 5 ml acid azotic 5% şi se amestecă bine centrifugdu-se din nou. Supernatantul se separă n aceeaşi capsulă. Peste fracţiunile extrase n tricloracetic se adaugă 5 ml acid azotic concentrat (d = 1,42) şi se ncălzeşte pe baia de nisip pnă rămn aproximativ 5 ml lichid. După ce s-a răcit se adaugă 0,5 ml pnă la uscare. Dacă reziduul nu este alb se mai adaugă 1 ml acid azotic şi 2-3 picături de acid percloric şi se evaporă din nou la sec. Se repetă operaţia pnă ce reziduul este perfect alb. Se adaugă apoi 2 ml apă bidistilată şi se evaporă iarăşi pnă la sec. Peste reziduul uscat se adaugă 10 ml acid azotic (1 :25) şi apoi conţinutul se trece cantitativ ntr-o plnie de separare cu porţiuni mici de apă bidistilată (să nu depaşească volumul final 40 ml). Se adaugă 15 ml soluţie tampon şi dacă proba se tulbură se mai adaugă soluţie tampon pnă la limpezirea completă.

Paralel se face o probă martor folosind 15 ml acid tricloracetic care se tratează la fel ca şi proba. n continuare se procedează la fel pentru determinarea plumbului n apă şi aer.

Calcul : g Pb/100 ml snge = C x 10

C = concentraţia n g Pb din proba de snge luată n lucru;

Obs.: valoarea normală a plumbemiei este de 30 g/100 ml snge.


Determinarea plumbului n urină

 

            Generalităţi: plumbul n urină se găseşte sub formă de combinaţii organice şi anorganice. Concentraţia plumbului din urină ne poate da unele indicaţii cu privire la impregnarea organismului cu plumb.

Principiul metodei: plumbul are proprietatea de a reacţiona cu ditizona, n mediu alcalin cu care formează un complex colorat n roşu, ditizonatul de plumb, colorimetrabil.

Reactivi:

-acid azotic (d= 1,40) ;

-acid azotic 1% şi 0,05%;

-cloroform;

-ditizonă 0,01% şi 0,05%;

-soluţia tampon de citrat ;

-soluţia de spălare;

-soluţia etalon stoc;

-soluţia etalon de lucru;

-permanganat de potasiu, soluţie saturată;

-soluţie de hidroxilamină 10%.

Recoltarea: urina se recoltează n vase bine spălate cu detergent şi clătite cu o soluţie de acid azotic 1:10 şi cu apă bidisitlată. Recoltarea urinei se face din prima emisiune de dimineaţă sau din urina colectată n 24 de ore.

Mod de lucru: ntr-o capsulă de porţelan se introduc 25 ml urină şi se adaugă 2,5 ml acid azotic (d = 1,42) şi 8,5 ml soluţie saturată de parmanganat de potasiu. Se ncălzeşte pe baia de nisip, moderat, pnă ce lichidul supernatant devine limpede şi incolor. Pe fundul vasului trebuie să persiste un rest de precipitat brun. n caz contrar se mai adaugă cţiva ml de permanganat continudu-se ncălzirea. După răcirea parţială a soluţiei, se tratează excesul de permanganat cu hidroxilamină, adăugndu-se picătură cu picătură pnă la dispariţia completă a precipitatului brun şi apoi un exces de 2 ml. Paralel cu proba de urina se face un martor cu apă bidistilată şi care se lucrează n aceleaşi condiţii ca şi proba.

Se trece continutul din capsulă cantitativ ntr-o plnie de separare cu porţiuni mici de apă bidistilată să nu depăşească 40 ml. Se adaugă 15 ml soluţie tampon pnă la limpezirea completă.

Calcul: g Pb/dm3 urina= c/v ·V24

C= concentraţia n g Pb din proba de urină luată n lucru

V= cantitatea de urină luată n lucru, n ml

V24= cantitatea totală de urina eliminată n 24 de ore n ml

Obs.: Valoarea normală a plumbului n urină este de 50 g/urina/24 ore.


Determinarea enzimei ∆ amino-levulinic

Dehidraza (ALA-dehidraza)

 

Generalităţi: enzima ALA-dehidraza intervine n biosinteza hemului la etapa de cuplare a celor două molecule de acid molecule de acid ∆ amino-levulinic pentru a forma porfobilinogenul, precursorul nucleului porfirinic. Activitatea acestei enzime este inhibată n cazul expunerii organismului la plumb.

Principiul metodei: activitatea ALA-dehidrazei se determină prin dozarea colormetrică a porfobilinogenului din snge nainte şi după incubarea sngelui total cu acid ∆ amino-levulinic ca substrat.

Reactivi:

-acid ∆ amino-levulinic 0,01 M;

-reactiv;

-deproteinizant: acid tricloracetic 10%;

Recoltarea probelor: sngele se recoltează prin puncţie venoasă pe heparină.

Mod de lucru: n 2 eprubete de centrifugă care se notează cu P şi M se introduc n fiecare cte 0,2 ml snge heparinizat şi 1,3 ml apă bidistilată, se amestecă uşor şi apoi se introduc ntr-o baie termostat la 37˚C timp de 10’ pentru realizarea hemolizei. n eprubeta P se introduce 1 ml acid ∆ amino-levulinic (substrat) iar n eprubeta M 1 ml acid tricloracetic, se agită şi apoi 1 ml acid ∆ amino-levulinic. Ambele eprubete se ţin la incubat timp de 60’ la 37˚C. După incubare se adaugă şi n eprubeta P 1 ml acid tricloracetic. Se centrifughează ambele eprubete la 3000 rotaţii timp de 10’. Se ia din supernatant cte 1 ml şi se introduce n alte 2 eprubete peste care se adaugă 1 ml reactiv Ehrlich.

Calcul: unităţi ALA-dehidraza/ml eritrocite = 12,5 x E60 – E0/ % hematocrit x1000

E60= valoarea extincţiei probei din eprubeta P.

E0= valoarea extincţiei din eprubeta M.

Obs.: se consideră ca valori normale pentru activitatea ALA-dehidrazei 25 unităţi/l de eritrocite.            


Determinarea hematocritului

(volumul eritrocitelor)

 

Principiul metodei: sngele se centrifughează şi se separă eritrocitele de plasmă iar prin evaluarea raportului cantitativ ntre ele se obţine volumul eritrocitelor.

Reactivi şi material necesar:

-centrifuga;

-anticoagulant-heparina;

-material pentru recoltarea sngelui prin puncţia venoasă;

-hematocrit.

Recoltarea probei de snge: sngele se recoltează prin puncţie venoasă heparina (o picătură de heparină este suficientă pentru 5 ml snge).

Mod de lucru: sngele se introduce n hematocrit şi se centrifughează la 4000 rotatii timp de 20’. După centrifugare se măsoară nălţimea „h” a coloanei de eritrocite şi nălţimea „H” a coloanei totale de snge. Dacă tubul este gradat n mm se face citirea direct, dacă nu este gradat, nălţimea se măsoară cu ajutorul unei rigle.

Calcul: hematocrit% =100 x h/H.

h= nălţimea coloanei de eritrocite, n  mm;

H= nălţimea coloanei totale de snge, n mm;

Obs.: valori normale ale hematocritului: bărbaţi 44,9%; femei 40,7%.


 

 

Determinarea acidului ∆ amino-levulinic n urină

 

Generalităţi: ca şi coproporfirinele, concentraţia acidului delta-amino-levulinic creşte n urină n expunerea organismului la concentraţii crescute de plumb n urma perturbării biosintezei hemului produsă de prezenţa plumbului.

Principiul metodei: acidul ∆ amino-levulinic se separă din urină prin reţinerea lui pe o coloană cu răşini schimbătoare de ioni, cationică şi determinarea colorimetrică cu reacticul Ehrlich.

Reactivi şi material necesar:

-hidroxid de sodiu 1 N;

-acid clorhidric 1 N şi 2 N;

-tampon acetat, pH = 4,6;

-acetat de sodiu 2 M;

-acid acetic glacial;

-acid acetic soluţie 1 M şi 0,2 M;

-acetilacetonă;

-acid percloric 70%;

-răşină cationică DOWEX 50 - x 8, granulaţie 200-400 mesh forma H+;

-răşină anionică (pentru ndepărtarea porfobilinogenului) răşină DOWEX 2- x8 sau DOWEX 1- x8 cu granulaţia de 200-400 mesh sub formă de acetat;

-reactiv Erlich.

Recoltarea probelor: urina se recoltează din prima emisiune de dimineaţă sau din urina colectată n 24 ore şi se lucrează ct se poate de repede.

Mod de lucru: cele 3 coloane se aşează una deasupra celeilalte avnd grijă ca deasupra să fie coloana anionică. Se introduc n coloane 8 ml apă bidistilată şi se aşteaptă să treacă complet prin cele două coloane [n coloana anionică s-a reţinut porfobilinogenul iar n cea cationică acidul ∆ amino-levulinic (ALA)].

n coloana cationică se introduc 7 ml acetat de sodiu 1 M care este prins ntr-o eprubetă gradată de 10 ml. Se completează volumul la 10 ml cu soluţie tampon de acetat şi se adaugă apoi 0,2 ml acetilacetonă, se agită bine eprubeta se adaugă 2 ml reactiv Ehrlich şi se amestecă bine. Se lasă n repaus 15’ apoi se citeşte extincţia la spectrofotometru la lungimea de undă de 553 nm n cuva de 1 cm. Citirile se fac faţă de un martor preparat din 2 ml apă bidistilată şi 2 ml reactiv Ehrlich.

Calcul: mg ALA/dm3 urina =E553 x 47,6.

Valoarea normală a acidului ∆ amino-levulinic n urină este de 5,2 mg/urina din 24 ore.


 

Determinare porfirinelor urinare

 

 

Generalităţi: perturbarea biosintezei hemului este unul din efectele toxicităţii plumbului evidenţiată prin creşterea excreţiei urinare de coproporfirine şi acid ∆ amino-levulinic.

Principiul metodei: porfirinele urinare sunt extrase şi aduse n soluţie cu acid clorhidric apoi se măsoară extincţia la lungimea de undă maximă a bandei de absorbţie caracteristică porfirinelor. Concentraţia porfirinelor se calculează pe faza coeficientului de extincţie molar.

Reactivi:

-acid acetic glacial;

-eter etilic;

-acetat de etil;

-acid clorhidric soluţie 0,1 N şi 0,5 N;

-soluţie de iod 0,1 N;

-tiosulfat de sodiu, soluţie 0,1 N.

Recoltarea: urina se recoltează din prima emisiune de dimineaţă şi se păstrează cel mult 3 ore ferită de lumină, sau urina colectat n 24 ore n care se adaugă 2 ml toluen pentru conservare.

Mod de lucru: ntr-o plnie de separare se introduc 5 ml urină şi 1 ml acid acetic.

untitled

Dacă proba de urina este proaspătă, se oxidează prin adăugarea a 5 picături de soluţie de iod iar excesul se ndepărtează prin adăugarea a 5 picături de tiosulfat. Probele colectate n 24 ore nu se mai oxidează. Se adaugă 30 ml eter etilic şi se agită bine proba timp de 3’. Se separă stratul de urină n altă plnie. n prima plnie se adaugă de 2 ori cte 5 ml de apă bidistilată şi stratul apos se separă tot n cea de-a doua plnie.

Peste stratul eteric (plnia 1) se adaugă porţiuni succesive de cte 1 ml de HCl 0,1 N agitnd de fiecare dată plnia cte 1’ iar extracţiile acide sunt unite ntr-o eprubetă gradată de 10 ml. Sunt suficiente 4 extracţii cu acid şi se completează volumul pnă la 5 ml cu acid. Dacă concentraţia porfirinelor este prea mare, culoarea extrasului are o nuanţă roz. Se continuă extracţia cu acid pnă ce  ultima fracţiune extrasă nu mai prezintă fluorescenţă roşie la lumina ultravioletă şi n acest caz volumul final se completează pnă la 10 ml cu acid. n extrasul acid sunt conţinute coproporfirinele.

n plnia a doua n care se află urina şi apa de spălare se adaugă 30 ml acetat de etil şi se agită plnia 3’. Se ndepărtează faza apoasă iar stratul de acetat de etil se spală de 3 ori cu cte 5 ml apă bidistilată. Fracţiunile apoase se elimină. Peste acetatul de etil se introduc porţiuni de cte 1 ml HCl, 0,5 N şi n stratul acid sunt extrase uroporfirinele. Fracţiunile acide sunt unite ntr-o eprubetă gradată de 10 ml şi se completează volumul pnă la 5 ml acid clorhidric 0,5.

Extincţia extraselor acide se măsoară la spectofotometru la mai multe lungimi de undă şi anume: 380 nm, 401 nm, 405 nm.

Calcul: g coproporfină/dm3 urina =[2Emax –(E380+E430)]V/V1·817.

Emax= valoarea exticţiei la 401 nm;

E380= valoarea exticţiei la 380 nm pentru interferenţe;

E430= valoarea exticţiei la 430 nm pentru interferenţe;

V= cantitatea finală a extraselor acide (n ml);

V1= cantitatea de urină luată n lucru, n ml;

            g uroporfirine/dm3 urina=[2Emax –(E380+E430)]V/V1·831.

Emax= valoarea extincţiei la 405 nm.

Obs.: -pentru exprimarea rezultatelor la urina din 24 ore concentraţia aflată la litru se raportează la volumul de urină din 24 ore.

            -pentru obţinerea extincţiei maxime se fac citiri n zona ntre 396-410 nm, din 2 n 2 nm;

            -valorile normale ale coproporfirinelor urinare sunt de 120 g/urina din 24 ore;

            -valorile normale de uroporfirine urinare sunt de 20 g/urina din 24 ore.


Determinarea carboxihemoglobinei

 

            Generalităţi: oxigenul şi oxidul de carbon concurează pentru aceeaşi parte a hemoglobinei, dar afinitatea pentru oxidul de carbon a hemoglobinei este de 210 ori mai mare dect pentru oxigen. De aceea ntr-o atmosferă poluată cu oxid de carbon, oxigenarea ţesuturilor este deficitară din cauza creşterii procentului de carboxihemoglobină. Dacă nivelul carboxihemoglobinei este sub 10% din hemoglobina totală, presiunea parţială a oxigenului arterial este normală, totuşi la concentraţia de 4-10% s-au semnalat modificări fiziologice. Cnd carboxihemoglobina reprezintă 66% din hemoglobina totală, survine moartea.

            Principiul metodei: oxidul de carbon eliberat din caroxihemoglobină reduce soluţia de clorură paladoasă proporţional cu concentraţia oxidului de carbon. Excesul de clorură paladoasă se determină colorimetric cu iodura de potasiu:

            PdCl2 + CO + H2O →Pd + CO2 + 2HCl

            PdCl2 + 4IK→[PdI4]K2 + 2KCL

            Reactivi şi material necesar:

            -clorură paladoasă;

            -hemolizant de fericianură;

            -iodură de potasiu, soluţie 20%;

            -celula de microdifuzie;

–celula se nchide ermetic cu un dop rodat.

            Recoltarea probelor: sngele se recoltează prin puncţie venoasă ntr-un tub mic n care s-a introdus n prealabil cca. 10 mg oxalat de sodiu şi o bilă de sticlă, umplndu-se complet. Se astupă cu un dop de cauciuc fără a lăsa bule de aer n interior şi se omogenizează prin răsturnare de 10-15 ori. n felul acesta proba se poate păstra 24 ore la rece.

            Mod de lucru: exact 1 ml din clorura paladoasă se introduce n compartimentul central al celulei iar n cel periferic se introduc 5 ml hemolizant de fericianură.

            Se măsoară exact 1 ml snge şi se introduce n compartimentul periferic apoi se nchide imediat celula. Se amestecă lichidele din compartimentul periferic prin rotire cu multă atenţie. Se lasă celula la temperatura camerei şi la ntuneric pnă a doua zi (minimum 6 ore).

            Se pipetează cu grijă, lichidul din compartimentul central ntr-un balon cotat de 50 ml, filtrndu-l. Se spală apoi cu porţiuni mici de apă bidistilată pnă ne-am asigurat că am trecut tot conţinutul. Se adaugă apoi n balon 10 ml de IK 20% şi se completează la semn cu apă bidistilată.

            Paralel cu proba se face un martor n care se pun numai reactivii fără snge. Se măsoară extincţia probei şi a martorului la spectofotometru, la lungimea de undă de 50 nm n cuva de 1 cm.

            Calcul: mg PdCl2 redusă= Es – Ep/Es.

Es= valoarea extincţiei martorului;

Ep= valoarea extincţiei excesului de clorură paladoasă rămasă n probă;

g COHb % din Hb totală = g COHb/100 ml snge/ g Hb totală/100 ml snge x 100.

Obs.: valoarea normală a COHb este de 1,5% din Hb totală pentru nefumători şi de 10% din Hb totală pentru fumători.


Determinarea oxidului de carbon din aerul expirat

 

 

Principiul metodei: aerul expirat se trece printr-un tub Drger care are o umplutură de I2O5. Oxidul de carbon reduce pentoxidul de iod la iod elementar care colorează n brun suportul alb.

Material necesar:

-o pungă de PVC prevăzută cu un tub de cauciuc la care este ataşată o clema şi se termină cu un tub de sticlă;

-aparatul Drger;

-tub Drger pentru oxid de carbon.

Recoltarea probelor: subiectul este scos din atmosfera poluată cu oxid de carbon şi este pus sa facă 2-3 inspiraţii şi expiraţii. Inspiră apoi profund, se menţine n apnee 20’’ după care suflă forţat aerul ntr-o punga de PVC care se astupa bine şi se transportă n laborator. Se ataşează la punga de PVC, pompa Drger la care aste fixat un tub Drger pentru a determina oxidul de carbon. Se aspiră aerul din pungă cu ajutorul pompei pnă cnd stratul alb din tubul Drger ncepe să se mbruneze, oprind pomparea cnd mbrunarea stratului a ajuns la o diviziune exactă. Se ţine cont de numărul de pompări care s-au efectuat. Se citesc diviziunile de pe tub pnă unde s-a mbrunat suportul şi se calculează oxidul de carbon după indicaţiile date n prospectul aparatului. Cunoscnd cantitatea de oxid de carbon din aerul expirat n ppm, se poate determina carboxihemoglobina, procentual din hemoglobina totală după formula: COHb% din Hb totala= ppm CO/ 5


Determinarea hemoglobinei totale

 

Principiul metodei: hemoglobina este oxidată de fericianură la methemoglobina care cu cianura de potasiu trece n cianmethemoglobina şi este derivatul cel mai stabil al hemoglobinei al cărei coeficient molar de extincţie este stabilit.

Reactivi: soluţia Drabkin: 0,14 g fosfat monopotasic, 0,05 g cianură de potasiu, 0,2 g fericianură de potasiu K3 [Fe (CN)6] se dizolvă n cţiva ml apă bidistilată. Se filtrează printr-o hrtie de filtru cantitativă, se adaugă n filtrat 0,5 g saponină, se agită şi se păstrează la rece şi n sticlă brună.

Recoltarea sngelui: sngele se recoltează prin puncţie venoasă sau din capilare pe un anticoagulant.

Modul de lucru: ntr-o eprubetă se introduc 5 ml reactivi Drabkin şi 0,02 ml snge bine omogenizat şi măsurat cu micropipeta care se descarcă introducnd pipeta n lichid fără a barbota. Se mai spală de 2-3 ori pipeta cu reactiv fără a produce barbotare. Se omogenizează proba prin scuturare şi după 10’ se măsoară extincţia la spectrofotometru la lungimea de undă de 542 nm faţă de reactivul Drabkin ca martor, n cuva de 1 cm.

Calcul: g Hb totală/ 100 ml snge= E542 x 36,8

Obs.: coeficientul molar de extincţie se poate determina dacă avem soluţii de hemoglobină standardizată dupa formulă: K= conc. Standard a Hb/ extincţie.

-concentraţia standard a Hb este nscrisă pe fiolă. n lipsa standardului de Hb se foloseşte coeficientul molar de extincţie 36,8;

-valori normale pentru Hb sunt: la bărbaţi – 14–16,5/ 100 ml snge; la femei – 13-/100 ml snge.


Determinarea methemoglobinei

 

Generalităţi: nitraţii şi nitriţii din mediu n concentraţie crescută pot da methemoglobinemii la copii pnă la vrsta de 1 an hrăniţi artificial. Implicaţii n oxidarea fierului din hemoglobină pentru formarea methemoglobinei sunt nitriţii. n apă nsă nitriţii se găsesc n concentraţie mică din cauza labilităţii lor care n prezenta oxigenului trec uşor n nitraţi iar absenţa acestuia face ca ei să se reducă la amoniac. Nitraţii n apă pot atinge concentraţii crescute şi foarte crescute iar la nivelul tubului digestiv al copiilor mici au posibilitatea să se reducă la nitriţi, datorită florei reducătoare abundente ce există la acest nivel.

Alte cauze care determină susceptibilitatea copiilor la methemoglobinemii sunt: labilitatea hemoglobinei de a trece mai uşor n methemoglobină, volum mic de snge, echipamentul enzimatic oxido-reducător, de la nivelul eritrocitelor slab dezvoltat, concentrarea nitraţilor din apă prin procesul fierberii şi prezenţa de lapte praf a unei cantităţi crescute de flora reducătoare.

Principiul metodei: methemoglobina se transformă n cianmethemoglobină care e mai stabilă şi are un coeficient molar de extincţie bine stabilit la lungimea de undă de 630 nm. Prin diferenţa dintre valoarea extincţiei nainte şi după adăugarea cianurii se obţine cantitatea de methemoglobină.

Reactivi:

-soluţii tampon de fosfaţi cu pH=6,6;

-soluţia de cianură de sodiu sau potasiu neutralizată;

-acid acetic 12%;

-fericianură de potasiu 20%;

-soluţie de amoniac 25%;

-oxalat de sodiu, cristale;

-saponină, substanţă.

Mod de lucru: sngele se recoltează din deget ntr-un tub mic de sticlă pe oxalat de sodiu.

ntr-o eprubetă se introduc 10 ml soluţie tampon şi se adaugă 0,1 ml snge descărcndu-se bine pipeta prin refulare de 2-3 ori n soluţia tampon. Se amestecă bine conţinutul eprubetei apoi se adaugă aproximativ 0,1 g saponină şi se agită eprubeta timp de 5’ pentru realizarea hemolizei.

Se citeşte extincţia la spectrofotometru, la lungimea de undă de 630 nm n cuva de 1 cm drum optic. După citirea extincţiei se adaugă direct n cuvă o picătură de cianură neutralizată, se amestecă bine cu o baghetă de sticlă şi dupa 2’ se citeşte din nou extincţia la aceeaşi lungime de undă.

Calcul: (A-B) · 65= g% methemoglobină

A= valoarea extincţiei nainte de adăugarea cianurii;

B= valoarea extincţiei după adăugarea cianurii;

65= coeficient extracţie molar.


Determinarea colinesterazei din snge

 

Generalităţi: activitatea colinesterazei din snge este sensibil influenţată de unele substanţe toxice cum ar fi pesticidele organofosforice. Este indicat să se determine aceeaşi probă de snge att activitatea colinesterazei din eritrocitate ct şi cea din plasmă.

Principiul metodei: prin măsurarea aceticolinei hidrolizată după incubare cu snge total se poate aprecia activitatea colinesterazei. Acetilcolina rămasă după incubare se determină colorimetric prin reacţia cu hidroxilamina cu care formează acetilhidroxilamina care cu clorura ferică dă un complex roşu, foarte stabil. Pentru a diferenţia activitatea celor două colinesteraze se foloseşte un inhibitor specific pentru pseudocolinesterază, numit diparcol.

Reactivi:

-tampon barburic pH = 7,4;

-clorhidrat de dietilamino-etil-fenotiazină;

-acid tricloracetic 10%;

-soluţia stoc de clorură de acetilonă;

-soluţia de lucru de acetilcolină;

-NaOH soluţie 3,5 N;

-HCl soluţie 4 N;

-hidroxilamină hidroclorică;

-soluţie alcalină de hidroxilamină;

-clorură ferică.

Recoltarea probei de snge: sngele se recoltează pe heparină sau pe alt anticoagulant.

Mod de lucru: se măsoară 0,2 ml snge şi se diluează cu 1,8 ml apă bidistilată, realizndu-se o diluţie de 1/10, se agită bine pentru a se face hemoliza. Se citesc extincţiile la spectrofotomentru la lungimea de undă de 520 nnm n cuva de 1 cm faţă de martorul de reactivi.

Calcul: activitatea colinesterazei se exprimă n g acetilonă hidrolizată ntr-o oră la 38˚C de 1 ml snge total.

Colinesteraza totală= E-E1/ E· 100.

Colinesteraza globulară =E-E2/E · 100.

Colinesteraza plasmatică: colinesteraza totală – colinesteraza globulară.

E= valoara extincţiei etalonului E.

E1= valoarea extincţiei colinesterazei totale.

E2=  valoarea extincţiei colinesterazei globulare.

Obs.: valori normale: -colinesteraza globulară= 34,5;

                                   -colinesteraza plasmatică= 16,8.

Raportul colinesteraza globulară/ colinesteraza plasmatică = 0,66.

Colinesteraza globulară se poate raporta şi la numărul de eritrocite/mm3.

Colinesteraza globulară/mm3 snge total / coliesteraza (n milioane).

 

Determinarea cromului din snge

 

Generalităţi: cromul hexavalent are o toxicitate crescută comparativ cu cel trivalent, absorbindu-se uşor pe cale digestivă, respiratorie şi prin piele. Este responsabil de frecvenţa crescută a cancerului pulmonar.

Principiul metodei: după mineralizarea sngelui cromul hexavalent formează cu difenilcarbazina  un complex colorat n roz-violaceu a cărui intensitate este proporţională cu concentraţia cromului.

Reactivi:

-H2SO4 d = 1,84;

-acid percloric 60%;

-acid azotic d= 1,40

-NaOH 10 N;

-permanganat de potasiu 0,1 N;

-azidă de sodiu 5%;

-fosfat monosodic (NaH2PO4 · 2H2O) 60%;

-difenilcarbazină 0,1% n alcool etilic;

-albastru de timol 0,4%;

-bicromat de potasiu soluţie standard.

Mod de lucru: 5 ml de snge total se introduc ntr-un flacon Erlenmayer peste care se adaugă 1 ml acid sulfuric, 2 ml acid percloric, 1,5 ml acid azotic şi 2-3 perle de sticlă. Se acoperă cu o sticlă de ceas şi se ncălzeşte pe baia de nisip pnă se obţine culoarea maronie. Se mai introduc cteva picături de acid azotic cnd are loc o reacţie energică. Se repetă adăugarea de acid azotic pnă cnd nu mai are loc reacţia. Se pune proba direct pe flacără pentru ndepartarea vaporilor albi de acid percloric. Se adaugă 10 ml apă bidistilată şi se continuă fierberea pe sită. Se răceşte şi apoi se adaugă o picătură de indicator albastru de timol şi hidroxid de sodiu pnă la culoarea roz. Se adaugă 0,5 ml permanganat de potasiu şi se introduce proba n baia de apă la 80˚C. Dacă culoarea roz a permanganatului a dispărut n 10’ se mai adaugă 0,3 ml permanganat şi se continuă fierberea 20’. Se scoate proba din baie şi se adaugă azidă de sodiu picătură cu picătură pnă la decolorarea completă. Se introduc 2 ml fosfat monosodic, pentru ndepărtarea interferenţei fierului şi 1 ml difenilcarbazină. După 5’ se citeşte extincţia la un spectrofometru la lungimea de undă de 540 nm n cuva de 1 cm.

Calcul: g Cr/100 ml snge= C/V · 100.

C= concentraţia n g Cr din proba de snge luată n lucru.

V= cantitatea de snge luată n lucru n ml.

Observaţii: valoarea normală a cromului n sngele total este de 10 g/100 ml snge.


Determinarea arsenului din păr

 

Generalităţi: arsenul este un toxic cumulativ. O expunere a organismului la un mediu poluat cu arsen face să crească concentraţia acestui element att n snge ct şi n urină. Un test mai fidel al expunerii la arsen l constituie determinarea lui n firele de păr.

Principiul metodei: proba de păr se mineralizează şi arsenul se determină colorimetric cu dietildicarbamatul de argint.

Reactivi:

-alcool etilic;

-eter etilic;

-acid azotic d=1,40;

-acid percloric 70%;

-acid clorhidric 20%;

Mod de lucru: aproximativ 3 g păr tăiat ct mai aproape de rădăcină se ţin 3-4 ore n eter etilic pentru degresare. Se filtrează şi se spală bine cu apă şi detergent, apoi se clăteşte cu apă bidistilată şi n  final cu alcool etilic. Se usucă la temperatura camerei ntre două hrtii de filtru. După uscare se cntăresc exact 2 g păr, se introduc ntr-un flacon Erlenmayer, peste care se adaugă 10 ml acid azotic concentrat. Se acoperă vasul cu o sticlă de ceas, se ncălzeşte pe baia de nisip pnă scade volumul la 2-3 ml. După răcire se introduc 5 ml apă bidistilată şi 10 ml acid azotic concentrat. Se continuă ncălzirea pe baia de nisip pnă ce lichidul devine limpede, galben pai şi nu mai emite vapori bruni. Dacă nu s-a ajuns la acest stadiu se mai adaugă cţiva ml apă bidistilată şi 2-3 ml acid azotic şi se continuă fierberea cu grijă ca să nu se carbonateze. Se răceşte proba şi apoi se adaugă 1 ml acid percloric şi 2-3 ml apă bidistilată. Se continuă ncălzirea vasului acoperit cu sticla de ceas pnă la decolorarea completă. Se ia sticla de ceas şi proba se ncălzeşte pnă la evaporare la sec. Pentru ndepărtarea urmelor de acid percloric se reia reziduul de 2-3 ori cu cte 5 ml apă bidistilată şi se evaporă. Reziduul trebuie să fie cristalin şi perfect alb. Se trece reziduul, cantitativ, cu 10 ml acid clorhidric 20% n generatorul aparatului de determinat arsenul şi se continuă determinarea.

Calcul: g As/100 g păr = C/g · 100

C= concentraţia n g As din proba de păr luată n lucru;

G= cantitatea de păr luată n lucru, n g.

 

Determinarea arsenului n snge

 

Principiul metodei: proba de păr se mineralizează şi arsenul se determină colorimetric cu dietildicarbamatul de argint.

Reactivi:

-alcool etilic;

-eter etilic;

-acid azotic d=1,40;

-acid percloric 70%;

-acid clorhidric 20%.

Mod de lucru: se recoltează sngele venos pe fluorura de sodiu. Se măsoară exact 10 ml snge şi se introduc ntr-un flacon Erlenmayer peste care se adaugă 10 ml acid azotic concentrat. Se fierbe pe baia de nisip şi se procedează n continuare ca la determinarea arsenului din păr.

Calcul: g As/100 ml păr = C/g · 100.

C= concentraţia n g As din proba de snge;

G= cantitatea de snge luată n lucru, n ml.

Obs.: cancentraţia normală a arsenului din snge este de maximum 10 g/100 ml.


Determinarea arsenului n urină

 

Principiul metodei: proba de păr se mineralizează şi arsenul se determină colorimetric cu dietildicarbamatul de argint.

Reactivi:

-alcool etilic;

-eter etilic;

-acid azotic d=1,40;

-acid percloric 70%;

-acid clorhidric 20%.

Mod de lucru: se recoltează urina din 24 ore. Se iau 200 ml urină şi se introduc ntr-un flacon Erlenmayer peste care se adaugă 10 ml acid azotic concentrat. Se fierbe pe baia de nisip şi se procedează n continuare ca la determinarea arsenului n păr.

Calcul: g As/dm3 = C/V ·1000.

C= concentraţia n g As din proba de urină luată n lucru;

V= cantitatea de urină luată n lucru, n ml.

Obs.: concentraţia normală a arsenului n urină se considera a fi de 15-60 g As/dm3  sau 100 g As/urina din 24 ore.

Referat oferit de www.ReferateOk.ro
Home : Despre Noi : Contact : Parteneri  
Horoscop
Copyright(c) 2008 - 2012 Referate Ok
referate, referat, referate romana, referate istorie, referate franceza, referat romana, referate engleza, fizica